本科毕业论文
题目：去甲乌药碱对阿霉素诱导大鼠H9c2
心肌细胞损伤的保护作用
姓名：李宝月
学号：
院系：药学系
专业：药学
年级：级
指导教师：赵艳玲（研究员）
郝*荣（讲师）
二〇一八年六月
河北北方学院
学位论文使用授权及知识产权归属承诺
本学位论文在导师（或指导小组）的指导下，由本人独立完成。本学位论文研究所获的研究成果，其知识产权归河北北方学院所有。河北北方学院有权对本学位论文进行交流、公开和使用。
学生签名：年月日
河北北方学院
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学生签名：年月日
去甲乌药碱对阿霉素诱导H9c2心肌细胞损伤的保护作用
李宝月
河北北方学院药学系药学专业级
摘要
目的：探讨去甲乌药碱对阿霉素诱导大鼠H9c2心肌细胞能量代谢障碍的保护作用。方法：本实验采用CCK-8法检测不同浓度和不同时间点阿霉素、不同浓度去甲乌药碱对大鼠H9c2心肌细胞存活率的影响，筛选出适合的阿霉素终浓度、作用时间以及去甲乌药碱的给药浓度；生物能量分析仪检测去甲乌药碱对阿霉素诱导大鼠H9c2心肌细胞线粒体压力的影响。结果：阿霉素可剂量依赖性降低H9c2细胞的存活率，从而诱导心肌细胞损伤，最适给药浓度为5μM，作用时间为24h；去甲乌药碱在浓度为20μM的时候可显著升高心肌细胞氧耗率、基础呼吸、最大呼吸及ATP产量。结论：去甲乌药碱能够对抗阿霉素引起的心肌细胞损伤，其保护作用可能与其提高心肌细胞线粒体能量代谢有关。
关键词:去甲乌药碱；阿霉素；H9c2心肌细胞；心肌保护；能量代谢
PROTECTIVEEFFECTOFHIGENAMINEONDOXORUBICININDUCEDH9c2CELLINJURY
LIBaoyue
PharmacySpecialty,Grade
DepartmentofPharmacy,HebeiNorthUniversity
ABSTRACT
Objective:InordertoinvestigatetheprotectiveeffectofhigenamineondoxorubicininducedenergymetabolismdisturbanceinH9c2cardiomyocytesofrats.Methods:TheeffectsofdoxorubicinanddifferentconcentrationofdoxorubicinonthesurvivalrateofH9c2cardiomyocytesinratsweredetectedbyCCK-8method,andthesuitableconcentrationofdoxorubicin,thetimeofactionandthedosageofhigenaminewerescreened.ThebioenergyanalyzerwasusedtodetecttheH9c2heartofdoxorubicininducedratinducedbydoxorubicin.Theeffectofmitochondrialpressureonmusclecells.Results:TheresultsofthisstudyshowedthatdoxorubicincouldreducethesurvivalrateofH9c2cellsinadose-dependentmanner,theoptimumdrugconcentrationforinducedcardiomyocyteinjurywas5μM,thetimeofactionwas24h,andtheoptimumconcentrationofhigenaminewas20μM,andhigenaminecouldsignificantlyincreasetheoxygenconsumptionrate,basalrespiration,maximumrespirationandATPproductionofcardiacmyocytes.Conclusion:HigenaminecanprotectthemitochondrialenergymetabolismdisorderinducedbyadriamycinH9c2cardiomyocytesbyimprovingtheoxygenconsumptionrate,basalrespiration,maximumrespirationandATPproductionincardiacmyocytes.
Keywords:higenamine;doxorubicin;H9c2cardiomyocytes;cardioprotection;energymetabolism
英文缩写
去甲乌药碱对阿霉素诱导H9c2心肌细胞损伤的保护作用
前言
据年全球非传染性疾病现状的报告[1]，由心血管疾病所致的过早死亡率虽有所降低，但每年死于心血管疾病的人数仍然比其他任何死亡原因都多，是威胁全球人类健康的头号疾病。而心力衰竭是各种心血管疾病进展的终末状态，往往伴随着能量代谢底物利用的转变、线粒体功能异常以及心肌细胞能量代谢障碍，导致心肌收缩功能不全和左室重构进展[2]。近年来，心力衰竭与心肌能量代谢的关系成为临床研究的热点，能增强心肌线粒体能量代谢的药物均有治疗心力衰竭的潜力[3]。现代研究表明热性中药可通过调节阳虚动物、心衰细胞线粒体胞内Ca2+浓度变化，提升线粒体能量代谢功能，从而发挥抗心力衰竭的作用[4～6]。
阿霉素(doxorubicin,DOX)，又称多柔比星，为临床常用的蒽环类广谱抗生素。临床上广泛应用于各种恶性肿瘤，如恶性淋巴瘤、白血病、肺癌等的治疗[7～8]。然而由于其对心肌组织的靶向*性，限制了其在临床上的广泛应用。目前,DOX诱导的心肌细胞损伤模型广泛应用于心肌细胞凋亡的研究。除此之外，国内外还有专家通过研究发现阿霉素所致心肌损伤的机制主要集中在氧化应激、钙超载、内质网应激、线粒体损伤等[9,10]方面，而阿霉素引起的线粒体能量代谢障碍是其诱导心力衰竭的重要机制[3]。但是国内外研究去甲乌药碱对抗阿霉素的作用及相关机制的研究较少，因此本研究旨在从能量代谢角度考察去甲乌药碱对阿霉素诱导大鼠H9c2心肌细胞损伤是否有保护作用，并且探讨了其作用机制。采用盐酸阿霉素诱导大鼠H9c2心肌细胞损伤模型，探讨去甲乌药碱是否可通过改善心肌细胞损伤从而缓解阿霉素的*性作用，为临床上治疗心力衰竭提供潜在的治疗药物。
中药中具有回阳救逆功效的附子对于心力衰竭等病症有很好的疗效，Zhang等人[11]研究发现，附子可通过增加线粒体呼吸链复合体I-IV的含量，调节线粒体钙单向转运体蛋白表达，提升线粒体能量代谢功能，从而发挥抗盐酸普罗帕酮致急性心力衰竭的作用。周远鹏[12]研究发现附子中水溶性成分如去甲乌药碱、附子苷、去甲猪毛菜碱等对心血管系统具有广泛而明显的药理作用，其中具有β-肾上腺素能受体部分激动剂样作用的去甲乌药碱能通过增加心肌收缩力，扩张冠脉血管从而发挥强心作用。然而，有关去甲乌药碱的强心机制仍缺乏深入地研究，本研究旨在探讨附子中具有强心作用的去甲乌药碱否能够通过提升线粒体能量代谢功能从而发挥抗阿霉素诱导的大鼠H9c2心肌细胞能量代谢障碍作用，为去甲乌药碱的强心作用提供理论依据。
材料与方法
1.试剂与仪器
1.1试剂
盐酸阿霉素（批号：CHB，成都克洛玛生物科技有限公司)
去甲乌药碱（批号：CHB，成都克洛玛生物科技有限公司）
CellCountingKit-8（Cat.No:HY-KLot.No:,MCE）
海马XFp细胞线粒体压力测试试剂盒（Cat.No:10-Lot.No:，安捷伦科技有限公司）
二甲亚砜（DMSO）（Cat.No:D-MLLot.No:RNBF,SIGMA）
胎牛血清（FBS）（由解放*第三〇二医院中心实验室提供）
DMEM高糖培养基（由解放*第三〇二医院中心实验室提供）
胰蛋白酶（由解放*第三〇二医院中心实验室提供）
磷酸盐缓冲液（PBS）（由解放*第三〇二医院中心实验室提供）
1.2仪器
SeahorseXFp分析仪（安捷伦科技有限公司，美国）
Haier医用低温保存箱（青岛海尔特种电器有限公司，中国)
SynergyH1全功能酶标仪（美国伯腾仪器有限公司，美国)
HS-恒温水浴锅（太仓市华利达实验设备有限公司）
YDS-50B-东亚牌液氮容器（乐山市东亚机电工贸有限公司，中国)
倒置相差显微镜（德国莱卡公司，德国)
TD5A离心机（湖南赫西仪器装备有限公司）
洁净工作台（北京冠鹏净化设备有限责任公司）
CO2恒温培养箱（由解放*第三〇二医院中心实验室提供）
2方法
2.1大鼠H9c2心肌细胞的培养
本研究所采用的大鼠H9c2心肌细胞株来源于大鼠胚胎时期心脏组织，由北京协和细胞资源中心（CRC/PUMC）提供，在37℃，5%CO2的饱和湿度的恒温培养箱中，利用含10%胎牛血清，1%青霉素-链霉素双抗溶液的DMEM高糖培基培养。当细胞贴壁率达到80%～85%时，先使用PBS润洗细胞，然后采用胰酶消化，最后利用血细胞计数器计数后传代，需要每隔2～3天传代1次。取对数生长的细胞接种于孔板中。
2.2实验药液的配制
使用前将采用DMSO将盐酸阿霉素、去甲乌药碱分别配置成浓度为20、20、10mM的储备液，临时使用时采用培养基配置成所需浓度即可。
2.3实验分组
实验分组为正常对照组（正常培养的心肌细胞）、模型组（阿霉素组）、去甲乌药碱组（去甲乌药碱预处理2h后再加入阿霉素）。
2.4去甲乌药碱和阿霉素药物浓度的摸索
2.4.1采用CCK-8法测定心肌细胞活力
药物干预结束后，采用酶标仪在nm波长处测定各孔的OD值，细胞存活率的计算公式如下：
细胞存活率=[(As-Ab)/(Ac-Ab)]×%
其中，As为实验孔吸光度，含H9c2心肌细胞、DMEM培养基、CCK-8溶液和相关药物溶液；Ac为对照孔吸光度，含H9c2心肌细胞、DMEM培养基、CCK-8溶液，不含任何溶液药物；Ab为空白孔吸光度，含DMEM培养基、CCK-8溶液，不含H9c2心肌细胞和相关药物溶液。
2.4.2心肌细胞的接种和培养
将H9c2心肌细胞传代后，按8×个·ml-1的密度采用含10%FBS的DMEM高糖培养基接种于96孔板中，每孔种植μL，待细胞生长至80%以上密度时，吸弃上清液，加入相应药物进行干预。
2.4.3CCK-8法检测不同浓度阿霉素对心肌细胞活力的影响
按照2.4.2的方法接种H9c2心肌细胞，吸弃培养基，采用不同浓度阿霉素（20、10、5、3、1、0.1μM）对细胞进行干预，每组设置3个复孔，每孔中对应加入μl上述浓度阿霉素，24h后采用CCK-8法检测细胞存活率。
2.4.4CCK-8法检测阿霉素在不同时间点对心肌细胞活力的影响
在前述实验结果的基础上，选择5μM的阿霉素作为干预终浓度，CCK-8法检测阿霉素在不同作用时间点对心肌细胞存活率的影响。
按照“2.4.2”的方法准备心肌细胞，吸弃培养基，采用5μM的阿霉素对细胞进行干预，每组设置3个复孔，每孔中对应加入μl上述浓度阿霉素，在不同作用时间点（0,12,24,36,48,60,72h）后，分别用CCK-8法检测细胞存活率。
2.4.5去甲乌药碱对正常H9c2心肌细胞存活率的影响
按照“2.4.2”方法接种心肌细胞，待心肌细胞贴壁率高于80%时，采用不同浓度去甲乌药碱（80、40、20、10、5μM）对正常心肌细胞进行干预，每组设置3个复孔，每孔中对应加入μl上述浓度去甲乌药碱，24h后CCK-8法检测细胞存活率。
2.4.6去甲乌药碱对阿霉素致H9c2心肌细胞损伤的保护作用
按照2.4.2方法接种心肌细胞，待心肌细胞贴壁率高于80%时，每组加三种不同浓度去甲乌药碱（20、10、5μM），每种浓度设置3个复孔，每孔中对应加入μl上述浓度去甲乌药碱，2h后每孔加入5μM阿霉素，24h后CCK-8法检测细胞存活率。
2.5细胞生物能量代谢检测方法
2.5.1XF分析培养基的配制
每mLAgilentSeahorseXF基础培养基中加入1.0g葡萄糖，5mLmM的丙酮酸钠，5mLmM的谷氨酰胺，配成SeahorseXF分析培养基中，于37℃恒温水浴锅温浴后采用0.1NNaOH调节pH至7.4，经0.22μm微孔滤膜过滤除菌后，4℃保存，临用前加热至37℃。
2.5.2实验条件的优化
细胞数量的优化：大鼠H9c2心肌细胞经胰蛋白酶消化后，采用培养基稀释成、、、、00/80μL,每孔80μL分别加入到SeahorseXFp细胞培养板中，每组3个复孔，其中背景孔中仅加入培养基，不接种细胞，待细胞贴壁后，显微镜下观察细胞密度。
FCCP浓度的优化：选定细胞数量之后，通过配置不同浓度的FCCP，运行程序进行测定。
2.5.3氧耗率的测定
氧耗率（oxygenconsumptionrate，OCR）的测定采用线粒体压力测试试剂盒进行检测，细胞接种、药物干预后，通过加入5μM鱼藤酮/抗霉素A（rotenone/antimycinA）处理并测定不同时间点的OCR值，以反映心肌细胞的氧化磷酸化水平，SeahorseXF细胞线粒体压力测试参数如图1所示。心肌细胞氧耗率公式如下：
非线粒体耗氧率=加入鱼藤酮/抗霉素后最低氧耗率
2.6统计分析
本研究所用统计均采用统计软件SPSS21.0完成；作图均应用OriginProPorable1.0.0.0作图软件完成；结果以x±s表示，用LSD-t进行均数之间的比较，P＜0.05表示两样本之间差异有统计学意义，P＜0.01表示两样本之间具有极显著性差异。
实验结果
1不同浓度阿霉素对H9c2心肌细胞的存活率的影响
为了选择合适的阿霉素浓度进行线粒体能量代谢障碍模型的建立，首先考察不同浓度阿霉素对H9c2心肌细胞存活率的影响。分别采用20、10、5、3、1、0.1μM的阿霉素处理细胞24h后用CCK-8法进行考察。结果显示，与正常对照组相比，各浓度阿霉素组心肌细胞存活率显著下降（P0.01）（图2）。由图中可以看出，随着阿霉素剂量的增加，H9c2心肌细胞的存活率逐渐降低，说明阿霉素对H9c2心肌细胞的*性具有剂量依赖性。根据数据分析结果，以对照组细胞存活率为%进行计算5μM阿霉素处理细胞24h后，各组细胞的相对存活率，细胞存活率＜60%为模型复制成功的标志，故选用5μM阿霉素处理细胞24h建立阿霉素损伤心肌细胞模型组。
25μM阿霉素在不同时间点对H9c2心肌细胞活力的影响
H9c2心肌细胞经5μM阿霉素作用不同时间点（0、12、24、36、48、60、72h）后，与正常对照组相比，不同时间点阿霉素组心肌细胞活力均显著下降（P＜0.01），作用24h后细胞活力降低至60%以下，故选择24h作为阿霉素的适合给药时间（图3）。
3去甲乌药碱对正常H9c2心肌细胞存活率的影响
为了考察去甲乌药碱对于正常H9c2心肌细胞的存活率的影响，从而得出去甲乌药碱的最大无*剂量，分别设置80、40、20、10、5μM浓度梯度的去甲乌药碱对正常H9c2心肌细胞进行干预，所得结果如图4所示。可以看出80和40μM的去甲乌药碱对正常H9c2心肌细胞有显著性的损伤作用（P＜0.01），因此，考虑到药物本身的对细胞的损伤作用，去甲乌药碱的最高给药剂量应控制在40μM以下。
4去甲乌药碱减轻阿霉素引起的H9c2心肌细胞损伤
根据前期对于阿霉素的造模剂量以及去甲乌药碱最大无*剂量的考察，选择5μM的盐酸阿霉素作为损伤H9c2心肌细胞的造模剂量，造模24h，考察预给药去甲乌药碱2h能否减轻阿霉素引起的H9c2心肌细胞损伤。去甲乌药碱的浓度均设置为：20、10、5μM，所得结果如图5所示。与对照组相比，去甲乌药碱+阿霉素组的细胞存活率明显升高（P0.05），而且随着剂量的增加，细胞存活率升高越明显。说明去甲乌药碱具有保护作用，而且可剂量依赖性地保护阿霉素引起的心肌细胞损伤，其中20μM作用最强。
5去甲乌药碱对阿霉素致H9c2心肌细胞氧耗率
在采用生物能量分析仪测定去甲乌药碱对于阿霉素致H9c2心肌细胞氧耗率的影响之前，我们摸索了最佳细胞密度以及适合的FCCP工作浓度。首先梯度设置细胞密度，待细胞贴壁后于倒置显微镜下观察，结果表明个·80μL-1每孔为适合的细胞密度，同时，采用生物能量分析仪测定出FCCP的适合工作浓度为10μM。
采用线粒体压力测试试剂盒检测去甲药碱对于阿霉素致H9c2心肌细胞氧耗率的影响，结果如图6所示：与对照组相比，阿霉素可降低大鼠H9c2心肌细胞氧耗率，表现出细胞能量代谢损伤；与阿霉素模型组相比，去甲乌药碱可升高心肌细胞氧耗率，体现出去甲乌药碱对心肌细胞能量代谢的保护作用（图6）。说明去甲乌药碱可保护阿霉素致H9c2心肌能量代谢障碍，对抗阿霉素对心肌细胞的*性作用。
附图
图1.SeahorseXF细胞线粒体压力测试参数
Fig.1SeahorseXFCellMitoStressTestProfile
图2.不同浓度DOX对心肌细胞活力的影响(x±s，n=3)
（与对照组相比，P＜0.01，☆表示与对照组相比）
Fig.2EffectsofdifferentconcentrationsofDOXontheviabilityofcardiomyocytes(x±s，n=3)(Comparedwiththecontrolgroup,P0.01,☆indicatesthat