研究背景
SH2B衔接蛋白3（SH2B3），也称为淋巴细胞衔接蛋白（LNK），在人体中由12号染色体上的SH2B3基因编码，主要在造血细胞和内皮细胞中表达。LNK在与造血、炎症和细胞迁移相关的信号传导途径中起调节作用。在小鼠体内，由于缺乏血小板生成素受体的负反馈调节，LNK的靶向缺失会通过JAK/STAT通路导致造血干细胞(HSC)扩增，骨髓生成、血小板增多和白细胞增多。同样，在人脐血HSC中，LNK的常见TT风险基因型(RW)会导致LNK功能降低和血小板生成素信号增加。研究发现，造血细胞LNK缺乏可以与高脂血症发生协同作用，共同促进血小板生成和活化、中性粒细胞增多、血小板-中性粒细胞聚集、动脉粥样硬化和动脉血栓形成，而血小板活化和血小板-中性粒细胞相互作用可促进中性粒细胞胞外杀菌网络(NETs)的形成，这些结构可以捕获并杀死细菌。然而，虽然NETs有助于抑制感染，但血管中NETs(NETosis)的形成是否会促进动脉粥样硬化和血栓形成呢？研究表明，在人和小鼠的动脉粥样硬化病变的表面、内部以及动脉血栓中发现了NETs。此外，NETosis必需酶肽基精氨酸脱亚胺酶4(PAD4)缺失或化学抑制可以减少冠状动脉疾病病变大小，并延迟动脉血栓形成。这些研究表明NETs可能会促进不稳定动脉粥样硬化斑块和动脉粥样硬化血栓形成。为了明确这一问题，哥伦比亚大学医学中心NanWang和AlanR.Tall在Circulation杂志上发表了题为《OxidizedPhospholipidsPromoteNETosisandArterialThrombosisinLNK(SH2B3)Deficiency》的研究性论文，研究表明，造血细胞Lnk缺失以OxPL依赖性方式促进NETosis形成导致不稳定动脉粥样硬化斑块和动脉血栓形成，并且LNK(RW)可能会引起JAKs突变体JAK2VF(JAK2VF)相关的冠状动脉疾病风险增加。研究发现
1.将野生型（WT）、Lnk-/-、Pad4-/-、Lnk-/-Pad4-/-小鼠的骨髓移植到Ldlr-/-小鼠，并喂食西式饮食10周。结果表明，造血细胞PAD4缺乏完全逆转了Lnk-/-BM受体中血栓的加速形成，但对Lnk+/+受体没有影响（图1A）。由于PAD4由中性粒细胞以外的其他白细胞表达，通过用Ly6G抗体阻断中性粒细胞结果表明PAD4促进了Lnk缺乏中的NETosis形成（图1B）。通过重合染色显示的NET主要出现在血栓表面。Lnk-/-小鼠血栓中的NET增加了7倍，PAD4缺失几乎完全逆转这种情况。（图1C）。这些结果表明NETosis以PAD4依赖性方式促进造血细胞LNK缺乏的高胆固醇血症小鼠的动脉血栓形成。图1.PAD4缺失逆转Lnk-/-小鼠中增加的NETs和动脉血栓的形成2.活化的血小板在促进NETosis形成中起主要作用。为了探索其加速NETosis形成的潜在机制，将WT或Lnk-/-中性粒细胞与凝血酶激活的WT或Lnk-/-血小板一起孵育，并使用H3Cit对NET进行染色，发现只有当Lnk-/-血小板与Lnk-/-中性粒细胞一起孵育时，NETs才会显著增加，表明Lnk-/-血小板和Lnk-/-中性粒细胞在增加NETosis中的作用（图2A）。为了研究从活化血小板释放的可溶性因子是否促进NETosis，从活化血小板制备上清液，结果显示出与Lnk-/-血小板或其上清液相似的活性。为了评估血小板释放出的脂质的潜在作用，制备了脂质提取物，并将其与Lnk-/-中性粒细胞一起孵育。结果显示从Lnk-/-血小板中提取的脂质与从Lnk+/+血小板中提取的脂质相比，Lnk-/-血小板中提取的脂质诱导更高水平的NETosis（图2B）。OxPL由活化的血小板释放，OxPL在体外促进NETosis形成，这表明从Lnk-/-血小板释放的可溶性OxPL可能在Lnk-/-中性粒细胞中诱导NETosis的形成。研究发现oxPAPC通过血小板激活因子受体(PAFR)表现出PAF样激动活性，该受体的拮抗剂WEB抑制oxPAPC在Lnk-/-中诱导的NETosis形成（图2C）。综上所述，Lnk-/-血小板释放的血小板活化因子（PAF）样OxPL通过激活Lnk-/-中性粒细胞中的血小板活化因子受体(PAFR)来促进NETosis形成。图2.Lnk-/-血小板释放的OxPL在Lnk-/-中性粒细胞中诱导NETosis3.E06(E06-scFv)单链可变片段的转基因通过逆NETosis来改善Lnk-/-小鼠的血栓形成和动脉粥样硬化。（图3）图3.E06-scFv可逆转Lnk-/-小鼠中增加的NET和动脉粥样硬化4.为了测试这些发现与人类相关性，通过CRISPR/Cas9介导的基因编辑产生了同基因LNK(TT)和同基因LNK(CC)诱导的多能干细胞(iPSC)来检测，发现人iPSC衍生的LNK(TT)血小板/巨核细胞和中性粒细胞的NETosis增加。5.在JAK2VF受试者中评估了LNK(RW)对CAD的影响，发现LNK(RW)纯合子的JAK2VF受试者易患CAD。（图4）图4.Jak2VFLnk+/-小鼠的NET增加和血栓形成加速研究总结
造血细胞LNK缺失小鼠的动脉粥样硬化的病变部位和动脉血栓中NETs增加，但PAD4缺乏几乎完全逆转了NETosis形成和LNK缺失的高脂血症小鼠的颈动脉血栓形成，这表明NETosis在早期颈动脉粥样硬化病变中加速血栓形成中起主要作用。结论总结
在机制层面上，研究发现，从LNK缺失的血小板中释放的OxPL与中性粒细PAF受体结合促进NETosis生成，但是通过E06转基因中和OxPL逆转了血小板活化和血栓的形成。在翻译水平上，研究发现LNK(RW)导致同基因人iPSC衍生的巨核细胞/血小板和中性粒细胞中细胞因子信号传导的抑制减少，导致NETosis增加。论文亮点
1.Lnk缺失的高胆固醇血症小鼠表现出动脉血栓的加速形成，血栓中的NET增多，但这些变化会被PAD4缺失或OxPL抗体逆转。2.高脂血症小鼠的LNK缺失血小板在被激活时释放大量OxPL，当与Lnk缺失的中性粒细胞一起孵育时会促进NETosis的形成。3.抗OxPL抗体可降低血浆OxPL水平、NETosis和动脉血栓形成，特别是在LNK缺失小鼠中。4.使用OxPL抗体靶向动脉粥样硬化、血栓形成可能对LNK功能降低或JAK/STAT信号增加的遗传人群特别有效。讨论
研究表明，在Lnk-/-小鼠中观察到在NETosis的增加和血栓的加速形成中，OxPL在血浆和血小板中起主要的作用。OxPL是在组织损伤过程中形成的，并且与多种疾病的发病机制有关。在逆转血栓的加速形成时，E06-scFv降低了血浆OxPL的增加水平，并且增加的量与活化的Lnk-/-血小板表面结合，这首次证明了E06-scFv可以降低血浆OxPL的水平。同时研究表明PAD4缺乏对动脉粥样硬化的影响很小，也就是PAD4缺乏不会减少小鼠病变部位的斑块大小，但它可以降低内皮损伤和血栓形成的程度。另外，功能降低的LNK变体（RW）和JAK2VF之间的遗传相互作用，可以增加CAD风险，也就是LNK(RW)增加了JAK2VF患者的CAD风险。总之，使用遗传方法来干扰NETosis表明NETs对高脂血症LNK缺失小鼠动脉血栓形成的作用。减少NETosis的新策略，如PAD4抑制剂或用OxPL中和抗体治疗，可以降低具有常见LNK（RW）风险变异的个体（包括JAK2VF）动脉粥样硬化血栓形成的风险，这可以帮助更多的患者免受冠状动脉疾病的困扰，治愈更多人的疾病。文献链接
HuijuanDou,AndrianaKotini,WenliLiu,TrevorFidler,KaoriEndo?Umeda,XiaoliSun,MalgorzataOlszewska,TongXiao,SandraAbramowicz,MustafaYalcinkaya,BrianHardaway,SotiriosTsimikas,XuchuQue,AlexanderBick,ConnorEmdin,PradeepNatarajan,EiriniP.Papapetrou,JosephL.Witztum,NanWang,AlanR.Tall.OxidizedPhospholipidsPromoteNETosisandArterialThrombosisinLNK(SH2B3)Deficiency.Circulation,:–.