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导读
血管平滑肌细胞(VSMC)长期以来一直与表型调节/可塑性或去分化有关。细胞谱系示踪、单细胞RNA测序和人类基因组学方面的创新技术已经广泛应用于对VSMCs在动脉粥样硬化中细胞表型的分子重编程的研究当中。目前的思考是，收缩性VSMC的一小部分细胞亚群明显经历了命运的转变，这种过渡性多能细胞可以呈现出斑块不稳定（炎症，骨化）或斑块稳定（胶原基质沉积）的细胞状态。参与这种VSMC命运和状态变化的若干种介导因子正在逐渐被研究者们探索和揭示，这对理解冠状动脉疾病风险和开发新的治疗方式具有重要的意义。在这里，作者简要总结了2篇Circulation和另一篇NatureMedicine中的一些技术和概念性的研究进展，这些进展共同阐明了新的研究方向，为进一步探索VSMCs在动脉粥样硬化疾病中的作用提供了参考。
论文ID：FateandStateofVascularSmoothMuscleCellsinAtherosclerosis
译名：动脉粥样硬化中血管平滑肌细胞的命运和状态
期刊：Circulation
IF：23.
发表时间：年5月25日
通讯作者单位：华盛顿大学西雅图儿童研究所儿科系发育生物学和再生医学中心。
DOI：10./CIRCULATIONAHA..
主要内容
年，借助电子显微镜科学家们首次提出了在人类动脉粥样硬化中的血管平滑肌细胞（VSMC）中存在“平滑肌与泡沫细胞之间的过渡阶段”的概念。随着分子探针技术的发展，研究者们可以使用探针用于动脉粥样硬化中和体外培养的VSMC中的一些关键基因的表达及其编码蛋白的研究。这些关键基因和它们编码的蛋白促使平滑肌细胞经历了从收缩性VSMC状态转分化为富含脂质的巨噬细胞样状态。细胞谱系示踪技术在动脉粥样硬化小鼠模型中的发展和研究进一步验证了VSMC到巨噬细胞转分化的观点，并证实了几十年前在动脉粥样硬化中少数VSMC衍生的细胞发生的克隆扩增的理论。细胞谱系示踪技术和单细胞RNA测序(scRNA-seq)技术共同揭示出动脉粥样硬化中VSMC存在转录组异质性，同时Cre-loxP小鼠模型也证明了VSMC相关基因在动脉粥样硬化中的重要作用。这些研究强调了建立创新技术在研究VSMCs从收缩状态到类似其他细胞类型的状态转变的重要性。然而，尽管VSMCs在动脉粥样硬化中的表型可塑性是毫无疑问的，但关于VSMCs的确切命运及其在这种慢性炎症疾病中的表型状态仍存在争议。
最近在Circulation上发表的两篇文章提供了直观的证据，这两篇文章证明了一个有着60年历史的想法，这个想法就是在动脉粥样硬化中收缩性VSMC和衍生的细胞之间的“过渡阶段”。结合了VSMC谱系示踪以及在小鼠和人类动脉粥样硬化血管的scRNA-seq和人类基因组学研究技术，这两项研究都证明了去分化的VSMC存在多种细胞类型的分化潜能，而去分化的VSMC衍生的多种细胞类型对于稳定或瓦解动脉粥样硬化斑块具有重要的作用。这些发现阐释了VSMC表型调控在实验和临床上动脉粥样硬化的重要性，并提供了大量新的值得探索的研究问题。在这里，作者们重点介绍了这些研究的主要发现以及用于解析在实验和临床上动脉粥样硬化中存在多能VSMC衍生细胞状态的综合技术。
动脉粥样硬化中的VSMC衍生过渡态细胞
Alencar等人将ApoE敲除的Myh11CreER小鼠和荧光报告基因小鼠交配，然后对其进行他莫昔芬诱导，来实现在血管中特异性标记VSMC。他们对小鼠严格进行高脂饮食处理，来诱导动脉粥样硬化，之后做了scRNA-seq，结果他们发现了7个不同的细胞群，这些细胞群包括之前提到的收缩性VSMC。他们进一步分析了每个细胞群中前个基因，揭示了不同的分子特征，包括炎症、细胞外基质生成和成骨状态。接下来，研究者们在VSMC限制性Krüppel样因子4(Klf4)缺失小鼠中重复了相同的研究，发现了半乳糖凝集素3(Lgals3)阳性细胞显着减少，导致成骨状态的细胞产生和VSMC标记的细胞高表达了VSMC收缩分子标志物，这可能是类似于Wirka等人提出的“纤维肌细胞”。先前的工作提出Lgals3+VSMC数量和动脉粥样硬化斑块水平在KLF4敲除老鼠发生了降低，这一现象说明了KLF4在平滑肌细胞分化过程中充当了分子命运开关的角色，从而为收缩性VSMC向无分化过渡状态的命运转换提供了转录机制。
Alencar等人还利用新型双报告基因小鼠精准示踪动脉粥样硬化病变中去分化的VSMC的细胞状态。这些研究表明，动脉粥样硬化病变中有60%的VSMC会提高Lgals3的转录水平，这些所谓的先驱细胞在动脉粥样硬化病变中产生炎症、分泌细胞外基质和呈现成骨细胞状态。然而，与先前的发现相反的是，尽管存在Lgals3（通常被认为是巨噬细胞的标志物），但很少有收缩性VSMC向巨噬细胞状态转变。动脉粥样硬化条件下，收缩性VSMC去分化为过渡性先驱细胞，注定会成为非巨噬细胞状态。但是值得注意的是，人颈动脉样本的scRNA-seq结果显示出类似的VSMC衍生的先驱细胞群，这些细胞可能会导致成骨（斑块不稳定）细胞状态。
与此同时，Pan等人在低密度脂蛋白受体(Ldlr)缺失小鼠中动脉粥样硬化主动脉的谱系标记的VSMC的scRNA-seq分析中发现了类似的过渡细胞。这种过渡细胞状态水平在动脉粥样硬化饮食过程中逐渐增加，并产生了3个巨噬细胞样细胞群和1个纤维软骨细胞群。类似于Alencar等人的研究，这些细胞群中的每一种都显示出VSMC收缩基因表达水平的降低，表明VSMC的一个去分化状态。因为先前的研究中，使用ApoE缺失诱导的动脉粥样硬化的模型和不同的报告基因，没有证明在动脉粥样硬化病变中存在VSMC去分化为巨噬细胞状态，因此Pan等人在ApoE缺失小鼠模型中重复了他们先前的研究，结果出现了相似的VSMC去分化细胞群，其中也出现了VSMC去分化的巨噬细胞态。Pan等人研究发现的过渡细胞状态表达了干细胞（Ly6a），内皮细胞（Vcam），和单核细胞/巨噬细胞（Ly6c1）的标志物，所以他们命名这些细胞为SEM细胞。SEM细胞就像Alencar等人提出的先驱细胞一样。根据来自人类颈动脉和冠状动脉病变的scRNA-seq数据，研究者们发现了一种转录相关的SEM细胞类型，表明这种过渡状态的保守性与VSMC的胚胎起源无关。
虽然Pan等人关于VSMC衍生的巨噬细胞状态的发现与之前的体内谱系示踪研究一致，但是他们却不同于Alencar等人和Wirka等人，后者在动脉粥样硬化病变中几乎没有发现VSMC衍生巨噬细胞。除了谱系示踪标记的异质量性因素，他莫昔芬的剂量和血管组织分析技术等客观因素值得研究者们注意，例如在分析动脉粥样硬化中巨噬细胞态则需要严格多方面分析巨噬细胞的不同分子标记，并结合脂质染色与谱系示踪或细胞状态分子标记去研究。虽然Geer等人提出了在人类动脉粥样硬化模型中存在VSMC衍生的泡沫细胞，但是这些细胞的分子状态仍然是具有争议性的。然而，这两项研究和Wirka等人的成果为实验条件和人类动脉粥样硬化中揭示复杂的VSMC向斑块细胞类型的过渡态提供无可争议的证据。每种VSMC衍生细胞状态在动脉粥样硬化发病机制中的相对重要性需要进一步探讨，因为许多患有严重冠状动脉疾病(CAD)及其后遗症的患者表现出正常的血脂指标。
独特的调控机制决定了动脉粥样硬化中VSMC衍生过渡细胞的命运
Alencar等人构建了ApoE缺失和高脂饮食共同诱导的胸主动脉粥样硬化模型，然后收集样本做了KLF4和OCT4的RNA-seq和染色质免疫共沉淀测序。KLF4靶标基因在KLF4基因敲除的VSMC中的表达水平降低，而在Klf4基因缺失的VSMC中升高的KLF4靶标基因在OCT4基因缺失的VSMC（例如，生肌基因）中表达减弱。这些对立的基因表达程序与Klf4基因缺失的VSMC（减少动脉粥样硬化病变）与OCT4基因缺失的VSMC（增加动脉粥样硬化病变）的病变病理学是一致的。值得注意的是，在与CAD相关的近40%的全基因组关联研究(GWAS)位点中，88个KLF4和OCT4目标是最接近注释的基因。由于染色质免疫沉淀测序实验是在小鼠中进行的，尚不清楚人类基因组中是否存在类似定位的KLF4和OCT4结合位点，以及与它们的结合是否对CADGWAS目标的表达改变有任何影响。KLF4基因本身是一个CADGWAS风险等位基因，其推定变异(rs)位于KLF4转录起始位点上游约kb。这种变异的性质尚不清楚。最近获得过诺贝尔奖的与成簇规则间隔短回文重复序列(CRISPR)基因组编辑相关的技术将能够对CAD风险等位基因附近的KLF4和OCT4结合位点进行功能定义。
Pan等人使用生物信息学手段深入研究了过渡态细胞的潜在的主要的调控因素。metaVIPER揭示了细胞视*酸结合蛋白2作为VSMC-SEM转变的主要调节因子。视*酸通过抑制血管疾病实验模型中的VSMC生长、迁移和病变来影响VSMC表型，大概是通过核受体介导的对VSMC基因表达的影响。核受体RARB在人动脉粥样硬化病变中表达水平降低，它和全反式视*酸在体外和体内都可以抑制VSMC-SEM转变。此外，全反式视*酸减少了动脉粥样硬化病变的内膜面积，并增加了纤维帽的VSMC细胞的比例。Pan等人然后把研究重点转向综合基因组学，在不稳定的人类动脉粥样硬化病变中发现了一些视*醇响应基因表达发生了下调。值得注意的是，这些基因与CAD相关的风险变异关系密切。然而这些关联需要后续不断的研究。
问题和未来方向
最近2项Circulation研究和一项较早的NatureMedicine研究整合了遗传学和基因组学中最先进的工具，证明实验性和临床动脉粥样硬化中VSMC的命运转变。所有3项研究虽然在设计和结论上略有不同，但都支持源自先前收缩性VSMC并具有独特分子特征的过渡细胞类型。另一项研究在人类动脉瘤形成模型中发现了VSMC衍生的过渡性间质干细胞群。这些令人兴奋的发现共同产生了新的问题。
首先，有限数量的VSMC是否有预定好的路线从中膜迁移并在内膜中发生命运转变，成为先驱或SEM细胞状态，还是完全是随机发生的？最近的一篇Circulation文章认为是前者，因为高表达NOTCH3的VSMCs似乎离开了中膜并在肺内膜病变中克隆扩张。对中膜VSMC的转录组、表观基因组和蛋白质组的进一步表征研究将有助于区分VSMC来源的迁移细胞在血管疾病中的迁移和扩增是确定性或随机性。尽管关于干细胞是否存在动脉的中间层存在争议，但是在血管壁中最丰富的细胞类型(VSMC)却拥有分化为多种不同细胞的潜力。
其次，先驱/SEM细胞在动脉粥样硬化病变中是否克隆扩张？虽然在3项研究中没有进行细胞增殖的研究。之前谱系示踪研究和Sca1先驱/SEM细胞的表达特征都证明了VSMC的克隆扩张。在这方面，最近的一份报告得出结论，Sca1+细胞在动脉粥样硬化中几乎不贡献形成新的血管平滑肌细胞。但是这仍有待研究是否发现了Sca1阳性的VSMC衍生的过渡细胞。一项使用了Confetti小鼠的研究支持了在动脉瘤形成模型中VSMC衍生的间质干细胞的克隆扩张。也许先驱/SEM细胞在早期胚胎VSMC发育过程中经过过渡状态的重新表达。另外，在人体中确定VSMC是否表达具有类似功能的基因非常重要。
第三，在动脉粥样硬化病变中VSMC衍生细胞类型的完整分子特征是什么，特别是对于在动脉粥样形成中日益发挥重要作用的长非编码RNA。鉴于当前scRNA-seq库构建和大多数长期非编码RNA的低丰度，解决此问题将充满挑战。但是，我们可以期待下一代测序的进步，这将增加单个细胞级别的测序精度。
最后，收缩性VSMC是否吞没脂质并释放具有动脉粥样硬化病变中的单核细胞/巨噬细胞样表型的炎症介质？尽管进行了几十年的研究，这个问题仍有待确定。
从临床角度来看，可以利用成像和纳米技术的进步来检测病变，以寻找斑块破坏稳定的因素。或者可以把研究重点放在过渡态细胞，将他们的命运偏向于斑块稳定细胞类型，如纤维肌细胞。
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