作者：杨尚栋贾竟
乔素冬贺颖郑红
心血管疾病（cardiovasculardisease，CVD），也称循环系统疾病，世界卫生组织将其定义为一组与心脏和血管有关的疾病，包括冠心病，脑血管疾病和高血压等［1］。《中国心血管健康指数（）》指出心血管疾病发病率、死亡率逐渐升高，已成为我国居民第一位死因［2］。根据《“健康中国”规划纲要》中遏制心血管疾病等慢性病的战略目标，寻找心血管疾病的防控发力点成为一种亟需［3］。近年来，随着对细胞外囊泡（extracellularvesicles，EVs）研究的不断深入，研究技术的不断进步，EVs在心血管疾病中发挥的作用逐渐被认识。EVs内容物相对稳定［4］，被认为是最具研究潜力的生物标记物。因此，系统性研究EVs对心血管疾病的临床检验具有重要意义。
一、细胞外囊泡
1.EVs的生物学特性：国际细胞外囊泡协会（InternationalSocietyforExtracellularVesicles，ISEV）将EVs定义为：细胞自然释放的、由脂质双分子层界定的、不可复制且无核的颗粒［5］。EVs根据其粒径大小和起源，可分为3类，分别是凋亡小体、微囊泡和外泌体。需要指出的是，由于提取方法的限制，微囊泡和外泌体在分离过程中很难得以完全分开。Witwer和Théry等［6］也推荐使用内涵更广的EVs来进行描述。因此，本文用EVs来统一描述与心血管疾病的相关研究。EVs几乎存在于所有体液中，包括血液、尿液、唾液、脑脊液等［7］。并且，EVs可由多种类型的细胞或结构释放，心肌细胞、内皮细胞等释放的EVs，均可参与多种心血管疾病相关的病理生理过程。EVs包含有多种蛋白质、脂质、核酸（DNA/RNA）、糖类、代谢物等成分，通过与靶细胞质膜的融合或受体-配体信号途径，使所携带的内容物进入靶细胞，调节其生物学功能。目前，通过EVs对心血管疾病的研究一般是对上述细胞进行培养，利用细胞培养基上清或者采集血液标本提取EVs来开展。除此之外，从心包积液、心脏灌流液和尿液获取的EVs用于心血管疾病的研究也有报道［8,9,10］。利用多组学对EVs内容物的全面剖析会更有助于提高对心血管疾病的认识［11］。2.EVs标本的采集与保存：标本的采集及保存对EVs的研究至关重要。血液作为EVs研究应用最为广泛的标本，国际血栓与止血协会（InternationalSocietyonThrombosisandHaemostasis，ISTH）建议，血液标本应当在采集后2h内分离血浆；为防止血小板的活化，该过程的温度应保持在20~25℃［12］。3.EVs的提取与鉴定：EVs常见的提取方法见表1。需要指出的是，不同类型的标本采用不同的提取方法所获得的EVs质量，回收率和纯度存在较大的差异，需要根据实验需求来选择最为合适的提取方法。表1常见的细胞外囊泡提取方法根据ISEV的建议，对EVs的鉴定应从3个方面展开：基于EVs形态学特征的透射电镜、EVs粒径和浓度检测的纳米颗粒跟踪分析（nanoparticletrackinganalysis，NTA）以及通过蛋白免疫印迹技术（WesternBlot，WB）对EVs标志性蛋白进行检测［5］。二、EVs与心血管疾病的发病机制和病理生理过程
在心血管疾病中，动脉粥样硬化和缺血再灌注损伤等会造成血管内皮细胞、心肌细胞等的损伤。这些细胞释放EVs到细胞外环境；而拥有不同的细胞来源，携带不同的表面标记和内容物的EVs通过细胞通讯介导与靶细胞的作用，参与心血管疾病的进程；从而提示疾病的发生发展。1.EVs与缺血再灌注损伤：急性心肌梗死导致组织灌注不足，而恢复组织的血流则会进一步诱发损伤促进内源性EVs释放。有研究表明从大鼠心肌细胞H9c2培养基分离得到的EVs富含微小RNA-a/b（microRNA-a/b，miR-a/b），通过与RNA结合蛋白Quaking（QKI）的3′非翻译区结合，降低其表达，加剧心肌细胞的缺氧/复氧损伤［22］。研究表明，急性心梗患者血清EVs富含miR-30a，EVs携带的miR-30a可通过调节自噬水平促进心肌细胞的凋亡［23,24］。EVs中丰富的微小RNA（microRNA，miRNA）在缺血再灌注损伤中还可发挥重要的心脏保护作用，如miR--5p和miR-［25,26］等。2.EVs与心脏肥大：病理性的心脏肥大是由于高血压、肺动脉高压、心肌梗死等引起的血流动力学超负荷而导致的，并最终转变为心力衰竭。血管紧张素Ⅱ（angiotensinⅡ，AngⅡ）在心脏局部水平的升高被认为是诱发心脏病理性肥大的一个重要因素。AngⅡ通过激活AngⅡ1型受体和2型受体增加EVs的释放，进而激活丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activatedproteinkinase，MAPK）和Akt蛋白激酶B（proteinkinaseB，PKB）以及肾素血管紧张素系统，加剧病理性心脏肥大［27］。有研究表明，心衰患者心脏组织中miR-的表达水平升高，一方面可通过靶向人类第十号染色体缺失与磷酸酶和张力蛋白同源基因（phosphataseandtensinhomologdeletedonchromosometen，PTEN）促进心肌细胞肥大；另一方面，心肌细胞通过释放富含miR-的EVs作用于成纤维细胞，促进成纤维细胞的增殖。这些结果说明miR-在心脏肥大和功能障碍中发挥重要作用［28］。因此，通过特定miRNA以及靶向调节通路的研究可为心脏肥大和心力衰竭提供新的治疗策略。3.EVs与心脏纤维化：心脏纤维化表现为心脏间质中细胞外基质蛋白的过度积累，导致心脏僵硬，收缩和舒张功能的障碍。心肌细胞通过释放富含miR-a的EVs可促进心脏成纤维细胞的增殖和肌成纤维细胞的分化，促进心脏的纤维化［29］。Kenneweg等［30］通过对转录组分析确定了两种对缺氧敏感的lncRNA：ENSMUST和Neat1。其中对Neat1的抑制能减少促纤维化基因的表达，说明Neat1可能促进心脏纤维化。4.EVs与血管生成：Beltrami等［8］从接受主动脉瓣置换术的患者中获取心包积液分离EVs，其中包含的let-7b-5p，可通过抑制TGFBR1（转化生长因子βⅠ型受体，transforminggrowthfactor-betareceptortype1）来促进血管生成。糖尿病作为心血管疾病的一个重要危险因素，血液中葡萄糖水平的升高可导致内皮功能障碍，血管生成不足。Wang等［31］的研究表明，心肌细胞通过释放富含miR-的EVs并转移至内皮细胞，抑制内皮细胞迁移和血管形成，在Ⅱ型糖尿病大鼠中发挥抗血管生成作用。5.EVs与血栓形成：有研究表明，高血流量和低血流量都会使白细胞及其释放的EVs中组织因子的水平升高，导致血栓的形成［32］。血小板表达的CD36分子，被认为以配体依赖的方式促进血栓形成［33］。相关研究表明，血小板来源的EVs含有多聚泛素可减少血小板的聚集，通过泛素化作用可抑制血小板CD36的表达，从而抑制动脉粥样硬化血栓的形成［34］。三、EVs作为心血管疾病生物标记物的潜力
EVs存在于几乎所有的体液中，通过分析其膜蛋白和内容物可为疾病的诊断及鉴别诊断提供参考，这一过程属于“液体活检（liquidbiopsy）”的范畴。EVs作为心血管疾病生物标记物的潜力见表2。表2EVs内容物作为心血管疾病生物标记物的潜力1.EV-miRNAs作为生物标记物的诊断价值：EV-miRNAs在疾病中作为生物标记物发挥越来越重要的作用。Wang等［35］的研究表明，心衰患者血浆EVs中的miR-和miR-水平降低与心脏纤维化的病理过程相关，可能成为预测心脏纤维化和心力衰竭的生物标志物。Escate等［36］证实了血浆EVs中miR-a水平的升高预示着高胆固醇血症患者在未来两年内（平均）将出现临床心血管事件。微流控技术是一种用来操纵极微量液体（10-9~10-18L）的新型技术，通过微流控芯片可以精准完成取样、处理、反应一系列检测分析过程。目前已成为生物医学、临床检验中最有前途的工具之一。Cheng等［20］设计的新型集成微流控系统，在5h内完成EVs提取及裂解、miRNA分离和检测，可将其应用于心血管疾病早期诊断。微滴度数字PCR（dropletdigitalPCR，ddPCR）是一种新的核酸检测和定量的方法。和传统的PCR技术相比，ddPCR采用绝对定量的方式，不依赖标准曲线和参照样本，直接检测目标序列的拷贝数，可用于低丰度的EV-miRNAs检测［37］。2.细胞外囊泡-环状RNAs（extracellularvesicles-circularRNAs，EV-circRNAs）等非编码RNA的诊断潜力：circRNA也可作为疾病诊断和预后的生物标记物。Vilades等［38］发现暴露于动脉粥样硬化条件下冠状动脉平滑肌细胞所释放的EVs内circRNAhsa_circ_的表达下调，证明其可作为冠状动脉粥样硬化鉴别的生物标记物。Yang等［39］发现CoroMarker（lncRNAAC.1）主要存在于血浆EVs中而比较稳定，通过对例冠状动脉疾病患者和名对照进行验证分析，也可作为诊断冠状动脉疾病的新型生物标记物。3.EVs相关蛋白的诊断潜力：EVs富含其来源细胞的蛋白，可特异性地反映疾病的动态变化。Kanhai等［40］进行了一项包含例心血管疾病患者的大型前瞻性队列研究，研究表明患者血浆EVs中的胱抑素C、丝氨酸蛋白酶抑制剂F2（serineproteaseinhibitorsF2，SerpinF2）和CD14蛋白水平的升高与心血管疾病患者未来心血管事件的发生及死亡风险的增加有关。EVs的蛋白组学分析也已鉴定出多种心血管疾病潜在的生物标记物，如血浆EVs中补体C1q亚单位A（