血小板来源的胞外囊泡（platelet-derivedextracellularvesicles，PEVs）是血小板被激活或凋亡后产生的直径在40nm-1?m的亚细胞双层膜结构，是血浆中含量最丰富的的囊泡。PEVs中包括各种生物活性分子，例如粘附分子、化学和细胞因子、凋亡调节分子、miRNA、凝血因子、酶、补体蛋白和生物活性脂质等，因此参与多种重要的生理及病理过程，包括血栓与止血，免疫应答与炎症，血管生成与伤口愈合以及肿瘤发生、发展与转移等。本文对血小板来源囊泡的生物学特征、功能、作用机制及临床应用等研究进展进行简要综述。
胞外囊泡；血小板；生物标志物；药物载体
胞外囊泡(extracellularvesicles，EVs)为直径约40nm-1um的亚细胞双层膜结构,在细胞间的信息通讯和物质传导中起着重要作用[1]。体内绝大多数细胞，包括免疫细胞、内皮细胞、干细胞、癌细胞、神经细胞等，均可分泌EVs[2,3]。血液中EVs主要由红细胞，白细胞，血小板，巨核细胞和内皮细胞等释放[4]，其中最丰富的是血小板来源的胞外囊泡（platelet-derivedextracellularvesicles，PEVs）。研究表明，健康人血浆中PEVs占所有囊泡的70％至90％[5,6]。PEVs中包括各种生物活性分子，例如粘附分子、化学和细胞因子、凋亡调节分子、miRNA等，另外还包括凝血因子、酶、补体蛋白和生物活性脂质[5]等，因此参与多种重要的病理生理过程，包括血栓与止血，免疫应答与炎症，血管生成与伤口愈合，肿瘤发生、发展与转移等[7]。本文对血小板来源囊泡的生物学特征、功能、作用机制及临床应用等研究进展进行简要综述。
一、血小板囊泡的生物学特征
血小板来源的囊泡（PEVs）直径为40-nm。根据粒径和来源，PEVs可分为两类：外泌体（exosomes），直径约40–nm，通过胞吐作用从多泡体（multivesicularbodies，MVBs）和α颗粒中释放；微囊泡（microvesicles,MVs），直径约–nm，也称为胞外体（ectsomes），通过细胞质膜出芽而释放[8]。另外，根据结构PEVs又可分为三类：单层膜结构的PEVs；多泡状的PEVs，即内部含有多个小泡的大囊泡；以及含有各种细胞器的高电子密度的PEVs[7]。
PEVs的表面分子、内含成分及它们与病理生理过程及疾病的关系是当前研究的热点。PEVs表面表达多种分子，包括血小板内皮粘附分子（PECAM-1；CD31），CD41（GpIb），CD42a，CD62p（P选择素），血小板因子4（PF4）和糖蛋白IIb/IIIa（GPIIb/IIIa）等[8]。已有研究表明，PEVs中包含生长因子、细胞因子、趋化因子以及促凝因子和抗凝因子，促炎因子和抗炎因子，促血管生成和抗血管生成因子，脂质和核酸（mRNA和miRNA）等[9]。通过PEVs蛋白组学研究[10-12]可对细胞生理过程中或疾病状况中PEVs的功能进行分析，也可为疾病生物标记物的研究提供基线数据。研究发现，PEVs中的活性成分与动脉粥样硬化、癌症等疾病具有密切关系[12]。对不同大小PEVs的蛋白组学和功能分析表明，PEVs可按大小进行分类，不同大小类别PEVs的蛋白质成分，蛋白质/脂质比率以及对血小板和内皮细胞的功能影响均不同。当前对于PEVs中的RNA成分的研究还较少。有研究对PEVs中的circRNA进行丰度检测，在微囊泡中鉴定了个circRNA，在外泌体中鉴定了个circRNA[13]。研究表明，PEVs是将miRNA转移至细胞并调节靶细胞基因表达的重要转运载体[14]。PEVs具有特定的miRNA图谱，一项研究在来自五个供体的PEVs中发现了种miRNA，其中48种在五个供体中共同表达[15]。
不同血小板激活剂（Ca2+载体，二磷酸腺苷，凝血酶，胶原蛋白，肾上腺素等）诱导血小板产生PEVs的机制各不相同，产生的PEVs在数量[8,16-18]、大小、形态[7]、膜分子和特定标志物的表达[18-20]及内含物[8,17]方面都有差异，因此具有不同的功能。研究表明，不同性别[21-23]、年龄[24]的健康人血浆中PEVs的数量呈差异性分布。在疾病状态下如血栓、炎症、感染和肿瘤等，PEVs的数量、内含物及表面标志物也会发生变化。
二．血小板囊泡的功能与生理病理机制
PEVs通过细胞间的信号转导参与多种重要的生理学和病理学过程，包括凝血与止血、血管生成、炎症、免疫调节、病*蛋白转运和肿瘤进展等[25]。PEVs主要通过以下机制影响靶细胞的生物学功能：（1）通过与靶细胞表面表达的PEVs特定配体（例如生长因子和生物活性脂质）结合形成“信号复合物”来刺激靶细胞；（2）表面受体如粘附分子，膜受体的细胞间转移；（3）将蛋白质和生物活性脂质、可能引起细胞的表观遗传重编程的mRNA、转录因子输送到靶细胞中。此外，PEVs还可作为传递传染性颗粒（如HIV，病*）以及传递完整细胞器（如线粒体等）的载体[26]。
1.凝血与止血：PEVs具有促凝和抗凝的双重特性，是调节凝血系统不可或缺的部分[27]。血小板在凝血与止血中起着核心作用，但有文献表明PEVs携带血栓前蛋白Annexin-V，X因子和凝血酶原，其凝血能力比活化血小板高50至倍[28]。PEVs凝血能力强可能与其表面磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine,PS）的高表达有关。磷脂酰丝氨酸是在血小板质膜的内表面上发现的带负电荷的分子，该分子会暴露在PEVs的表面。磷脂酰丝氨酸为肌张力酶和凝血酶原酶凝固复合体形成的促凝血结合位点，因此表面表达磷脂酰丝氨酸的PEVs会增加凝血酶生成的速度和程度，促进血栓形成[29]。在健康个体中，PEVs上整合素aIIbb3（CD41/CD61）也会支持纤维蛋白凝块的形成[30]。通过释放PEVs，血小板可以实现功能性自分泌自我扩增的机制来发挥其促凝血潜能[31]。另一方面，PEVs表面高表达CD41分子，它可通过不依赖TF和VII因子的途径产生低水平的凝血酶，该水平的凝血酶会激活蛋白C而发挥抗凝作用[32]。这表明PEVs不仅是促凝剂，同时通过抗凝蛋白维持凝血和抗凝的平衡参与凝血调节。
PEVs也参与了各种凝血和出血性疾病的发生发展。Castaman’s缺陷症是一种PEVs生成能力缺乏的疾病,患者有出血倾向。在这些患者中未检测到凝血酶原活性或PEVs内在特性的改变，表明PEVs的基础水平在凝血中具有潜在贡献[33]。相反，患有Scott综合征的患者PEVs计数正常，但促凝血酶原凝血酶活性降低[34]。这些患者中的PEVs由于PS向膜易位的缺陷而显示出受损的凝血能力。PEVs在其它出血性疾病中的潜在作用也有报道，例如免疫性血小板减少性紫癜(immunethrombocytopenicpurpura,ITP)。与有症状的ITP患者相比，无症状患者的PEVs水平更高，表明PEVs可能在该疾病中具有保护作用[35]。此外，研究表明，尽管ITP患者血小板计数低，但仍具有促凝血作用，部分原因可能是血液中PEVs水平升高，在一定程度上减轻了血小板被破坏所造成的出血倾向[36]。PEVs可通过促进凝血和维持组织完整性来帮助克服与ITP相关的凝血缺陷。然而，在一些ITP患者中，高水平的PEVs也与血栓形成风险升高相关[37]。
此外，在最新的一项研究中报道血栓形成过程中血小板的活化和消耗导致大量血小板衍生微粒（plateletderivedmicroparticles,PMPs）的释放，富含miRNAmiR--3p的PMPs能以正反馈方式影响造血干/祖细胞（hematopoieticstem/progenitorcells,HSPC),诱导巨核细胞的分化和血小板的生成[15]。
2.炎症及免疫调节：根据表面分子，内含物和微环境的不同，PEVs可在炎症中发挥促炎或抗炎双向所用[5]。PEVs通过释放趋化因子募集白细胞，包括T细胞，B细胞和单核细胞，并通过结合P-选择素和P-选择素糖蛋白配体-1(PSGL1)促进单核细胞与内皮细胞之间的相互作用，进而促进炎症[38]。PEVs还可上调中性粒细胞和内皮细胞上的活化标志物，并在体内外增加白细胞与内皮细胞的黏附来增强组织损伤后的炎症反应[39]。花生四烯酸可以从PEVs转移到单核细胞和内皮细胞，从而上调环加氧酶2的表达和诱导前列腺素的产生，引起血管舒张并使炎症细胞到达感染部位[26,40]。PEVs与单核细胞结合，可促进促炎性细胞因子IL-1β和肿瘤坏死因子TNF-a的升高[41]。PEVs还可通过CLEC5A受体激活中性粒细胞和巨噬细胞，诱导NET的形成并释放促炎细胞因子[42]。PEVs通过转移CD分子到B细胞而参与调节适应性免疫，刺激抗原特异性IgG的产生并通过与CD4+T细胞的协同活性来调节生发中心的形成[43]。PEVs能够将在其表面表达的受体（即CD41，CD61，CD，CD62P，PAR-1）转移至受体细胞（单核细胞，成肌细胞，造血干细胞）并诱导其粘附或增殖[44]。另外，PEVs将功能性gpIIb/IIIa（CD41/CD61）转移至嗜中性粒细胞，激活NF-kB信号通路，产生粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-GSF)并增强炎症[45]。
另一方面，PEVs也能发挥抑制炎症的作用。PEVs可将花生四烯酸12-脂氧合酶转移至肥大细胞，增加炎症脂蛋白A4（LXA4）的负调节剂的合成[44,46]。PEVs还能诱导幼稚CD4+T细胞分化为Foxp3+调节性T细胞，并且与T细胞孵育后可降低IFN-γ，TNF-a和IL-6的释放从而抑制炎症反应[47]。另外，PEVs可减弱酵母聚糖激活的巨噬细胞中TNF-a的释放，并修饰单核细胞向树突状细胞的分化，从而降低炎症和吞噬能力[48]。有文献提出，血小板活化产生PEVs的方式决定了所得PEVs对单核细胞的作用[49]。
PEVs在病*感染中也发挥作用。与健康人相比，HIV感染患者的PEVs水平更高[50]。并且PEVs能够将CXCR4（一种介导HIV进入靶细胞的趋化因子受体）转移至CXCR4阴性细胞，从而使其易于感染X4HIV菌株[51]。研究发现，多种病*如流感病*H1N1、HIV、登革热病*等可以激活血小板促进PEVs的释放[52]从而影响血液中的PEVs水平。
3.肿瘤：PEVs对肿瘤的发生发展也表现出促进和抑制的双向作用。PEVs对于肿瘤的促进作用主要体现在两个方面：一是促进肿瘤血管的生成，二是促进肿瘤细胞的迁移，侵袭和转移[26]。与PEV共同孵育后，金属蛋白酶1（MMP-1）从PEV中转移至癌细胞以及癌细胞中MMP-9，VEGF和IL-8mRNA表达增加导致肿瘤微环境（Thetumormicroenvironment,TME)中血管生成的增加[53]。此外，来自?颗粒的PEVs成分（如VEGF，血小板衍生的生长因子和成纤维细胞生长因子）也具有促血管生成特性。基质金属蛋白酶（MMPs）是在血管内和血管生成之前参与细胞外基质(extracellularmatrix,ECM)降解的主要酶。已显示PEVs可以促进MMP-2的分泌，尤其是在前列腺癌细胞中，从而促进血管侵袭[54]。PEVs作为磷脂酰丝氨酸的丰富来源，是免疫细胞上磷脂酰丝氨酸受体（phosphatidylserinereceptor,PSR）的可能配体。PS-PSR途径的激活可抑制TME以及血液循环中的先天性和适应性免疫反应[55]。PEVs介导的miRNA转移可以影响免疫反应、胞吞作用、肿瘤血管生成，以及其他与癌症相关的过程[56,57]。研究发现PEVs中含有的miR-和miRNA-与肿瘤的发生发展相关，miRNA-刺激内皮细胞的VEGF依赖性增殖，而miRNA-通过靶向内皮?1整联蛋白来抑制血管形成[58]。
另外，PEVs在多类细胞中具有转移miRNA和下调基因表达的能力，表明其本身可能具有抑癌作用。有研究报道PEVs可浸润人和小鼠的实体瘤，并在体内和体外将miRNA，尤其是miR-24传递给肿瘤细胞，诱导细胞凋亡并抑制肿瘤生长[56]。有研究表明，PEVs中miRNA-和miRNA数量增加，阻止了乳腺细胞系BT的细胞周期并减少了细胞迁移[59]。
阿司匹林已被证明可用于抑制癌症的进展[60]，这可能与服用阿司匹林导致血浆PEVs内含物中蛋白水平降低有关[61]。然而，阿司匹林具有多种副作用，包括出血风险增加，月经量大，恶心和呕吐等。通过抑制血小板释放PEVs而抑制癌细胞而不是抑制血小板的全部功能的新设计药物可能具有广泛的应用前景，并且其与肿瘤转移有关的PEVs的特异性靶向作用可避免因为对凝血功能的影响所导致的副作用。
4.组织修复：众所周知，富血小板血浆（Platelet-richplasma,PRP）是全血通过体外血液处理技术制备后，血小板含量高于全血水平的血浆成分，被广泛用于组织修复[62]。但是，对PRP诱导的组织修复的机制还尚未研究清楚[63]。随着对PEVs研究的深入，PEVs在组织修复方面的潜力已引起越来越多的