本文原载于《中华结核和呼吸杂志》年第6期
慢性阻塞性肺疾病(慢阻肺)患病率及病死率高，经济负担，为威胁全球公共健康问题的主要疾病。慢阻肺是低氧性肺动脉高压(pulmonaryhypertension，PH)的常见病因，多发生在慢阻肺中晚期，是影响疾病进程的独立危险因素[1]。肺血管重塑是慢阻肺相关PH的主要病理生理改变，远端肺小动脉重塑又是肺血管阻力升高、血管扩张度降低的主要原因[2]。肺血管重塑的基本病理改变包括肺动脉平滑肌细胞(pulmonaryarterysmoothmusclecells，PASMC)过度增殖和细胞外基质的沉积引起肺动脉肌化，小动脉内膜-中膜增厚和新生血管内膜形成[3]，最终导致血管壁增厚，弹性降低，管腔狭窄，血管阻力增加，从而发展为肺动脉高压，最终导致心室重塑、右心功能衰竭甚至死亡[4,5]。因此早期识别及治疗PH至关重要。心脏核磁共振(cardiacmagneticresonance，CMR)能够准确反映血流动力学及心脏结构的改变，识别早期右心室形态学和功能改变[6,7]。本研究尝试比较慢阻肺合并肺部肿瘤患者及肺功能正常合并肺部肿瘤患者的主肺动脉血液动力学、右心室形态及功能改变情况，探索慢阻肺患者远端肺小动脉结构改变对近端肺动脉血液流变学以及右心室结构、功能的影响及可能的机制。对象与方法
一、研究对象回顾性分析年9月至年3医院收治的因肺部肿瘤行手术治疗的患者共34例，其中男25例，女9例，年龄40～65岁，平均(56±8)岁。根据术前肺功能的情况分为慢阻肺合并肺部肿瘤组(慢阻肺组)15例，肺功能正常合并肺部肿瘤组(对照组)19例。慢阻肺诊断标准参照年GOLD指南[8]，根据术前肺功能分级标准分为轻度慢阻肺(肺功能1级)6例、中度慢阻肺(肺功能2级)9例。慢阻肺组均无接受长期家庭氧疗及呼吸机治疗病史。排除标准：经症状、体检及肺部影像学等各项检查符合支气管哮喘、间质性肺疾病等肺部疾病，存在精神障碍、幽闭综合征及无法耐受CMR检查。本研究符医院伦理委员会制定的关于人体试验的伦理学标准并获批准(批号：-)。所有患者均签署知情同意书。
二、方法1．CMR：
患者术前行GESignalHD3.0T超导磁共振扫描仪(美国GEHealthcare公司)扫描，梯度场为40mT/m，最大梯度切换率为T·m－1·s－1，使用相控阵心脏线圈，回顾性心电门控和呼吸门控技术。采用obliqueFiesta序列获得主肺动脉图像，在垂直长轴距肺动脉瓣环15～20mm处行快速电影相位对比序列获得幅度图及相位图。采用二维快速稳态进动采集序列(FIESTA)获得左、右心室两腔心和四腔心及短轴位电影CMR图像。使用ReportCARD3.6心功能分析软件测量相关参数：平均肺动脉压力(meanpulmonaryarterypressure，mPAP)[9]，主肺动脉扩张度(mPAD%)[10]，右心室舒张末期心肌质量(rightventricularmyocardialmassend-diastolic，RVMED)、右心室收缩末期心肌质量(rightventricularmyocardialmassend-systolic，RVMES)及心室质量指数(RVMI)[11,12]，参照相关文献进行估测。具体参数由2名经验丰富的核磁检查医生进行双盲、独立测量及计算。
2．肺组织病理：
于肺部手术过程中，取病变周围(5cm)目测正常的、约0.5cm×0.5cm大小新鲜标本(尽量避免钳夹肺组织)，使用预冷生理盐水冲洗2遍后使用无菌纱布擦拭干净，迅速置入液氮中快速冷冻，后期提取RNA及蛋白进行检测；另取一份标本进行常规固定石蜡包埋，制成3μm厚切片。行HE染色和改良Weigert弹力纤维染色(批号：DCB7)，光镜下观察。按说明书行α-平滑肌肌动蛋白(α-smoothmuscleactin,α-SMA)、增殖细胞核抗原(proliferatingcellnuclearantigen,PCNA)免疫组化染色。每张切片高倍视野随机选取3～5个结构完整的肺小动脉(横断面外径为～μm)[5]，采用Image-ProPlussoftware6.0图像分析软件测量血管壁厚度(wallthickness，WT)、外径并计算平滑肌厚度占血管外径的百分比(WT%)[13]、平滑肌面积占血管总面积百分比(WA%)[14]。软件分析α-SMA蛋白阳性细胞的吸光度值(A)[15]。PASMC增殖率＝PCNA阳性PASMC/PASMC总数×%。单位面积下增殖的PASMC＝PCNA阳性的PASMC/平滑肌总面积。
3．肺组织蛋白及mRNA表达水平检测：
(1)蛋白免疫印迹法(westernblotting)：根据试剂盒说明(批号：KGP，KGPBCA)提取肺组织蛋白并检测其含量。10%SDS-PAGE转移电泳，转膜、封闭，膜在一抗(山羊来源α-SMA1∶0，批号ab；兔来源GAPDH1∶0，批号：-1-AP)4℃孵育过夜。次日洗膜、室温孵育二抗(驴抗山羊HRP标记，1∶0；山羊抗兔HRP标记，1∶0)。ChemiDocMP成像仪拍照。IPP软件半定量分析条带。(2)实时荧光定量PCR技术(RT-QPCR)：使用TRIzol法提取肺组织总RNA。逆转录及荧光定量PCR试剂盒均购自日本TaKaRa(批号：RRA、RR)。PCR扩增条件：95℃预变性5s；94℃5s，60℃30s，45个循环。引物设计如下：α-SMA正向引物：5′-GACCGAATGCAGAAGGAGAT-3′，反向引物：5′-CCACCGATCCAGACAGAGTA-3′；GAPDH正向引物：5′-CAGCCTCAAGATCATCAGCA-3′，反向引物：5′-ACAGTCTTCTGGGTGGCAGT-3′。扩增效率采用相对定量分析法分析，即2－ΔCT表示[16]。以Rnase-freewater作为阴性对照，每例样本3个复孔。
三、统计学处理应用SPSS19.0版本软件进行统计分析。计量资料正态分±s表示，组间比较采用t检验。相关性分析采用Spearman相关分析。P0.05为差异有统计学意义。
结果
一、受试者一般临床资料慢阻肺组15例患者中肺叶楔形切除术8例，单肺叶切除5例，单侧全肺切除2例；腺癌8例，鳞癌3例，良性病变4例。对照组19例患者中肺叶楔形切除术9例，单肺叶切除8例，单侧全肺切除2例；腺癌12例，鳞癌4例，良性病变3例。两组患者在性别、年龄、吸烟史之间无统计学差异(P0.05)。两组患者在PO2、PCO2、FEV1/FVC占预计值%、FEV1占预计值%、DLCO占预计值%之间差异有统计学意义(P0.05，表1)。
二、对照组与慢阻肺组CMR主肺动脉血液流变学、右心室形态及功能改变慢阻肺组与对照组CMR测量下mPAP相比较无统计学意义(P0.05)，慢阻肺组CMR测量下主肺动脉最大内径、主肺动脉最小内径、主肺动脉最大面积、主肺动脉最小面积、平均反向流量(averagenegativeflow,ANF)、反流分数(regurgitantfraction,RF%)、RVMED、RVMES及RVMI高于对照组(P0.05)，mPAD%较对照组降低(P0.01，表2)。
三、对照组与慢阻肺组肺小动脉重塑情况改良Weigert弹力纤维染色显示：肺静脉管壁薄，而肺动脉内弹性膜明显，中膜明显增厚(图1，图2，图3)。HE染色显示：慢阻肺组肺泡形态不规则；支气管黏膜上皮不完整、增厚，纤毛倒伏、变短、不齐，杯状细胞增多、肥大，肺间质充血；广泛炎性细胞浸润；血管平滑肌细胞增生，管壁不均匀增厚、变形，管腔变小(图4，图5，图6)。
慢阻肺组与对照组血管外径差异无统计学意义[(±20)、(±19)μm，P0.05]。慢阻肺组WT、WT%及WA%分别为(37±18)μm、(65±19)%和(55±23)%，均高于对照组[(19±3)μm、(29±5)%和(40±7)%，均P0.05]。慢阻肺组肺小动脉平滑肌细胞增殖率及单位面积下增殖的细胞数分别为(34±11)%和(±)个/mm2]，均高于对照组[(11±7)%，(±)个/mm2，P0.05，图7，图8，图9，图10，图11，图12]。四、对照组与慢阻肺组肺组织α-SMA蛋白及mRNA表达水平蛋白免疫印记法、免疫组化及实时荧光定量PCR技术检测两组肺组织α-SMA蛋白及mRNA表达(图13)，结果显示慢阻肺组肺组织α-SMA蛋白表达吸光度值为(1.18±0.73)，mRNA表达量为(0.30±0.09)，均高于对照组(0.44±0.34、0.13±0.07，P0.05)。α-SMA在慢阻肺组肺小动脉平滑肌表达的吸光度值为(0.09±0.04)，对照组为(0.04±0.03)，组间比较差异有统计学意义(P0.01)。
五、相关性分析慢阻肺组肺小动脉重塑指标与mPAD%及气流阻塞程度呈负相关，与右心室质量、右心反流血量呈正相关。相关系数如下：WA%与mPAD%(r＝－0.42，P0.05)，WT%与mPAD%(r＝－0.50，P0.01)。WA%与RVMES、RVMED(r分别为0.34、0.37，P0.05)，WT%与RVMES、RVMED(r值分别为0.45和0.52，P0.01)。WA%与RF%(r＝0.27，P＝0.13)，WT%与RF(r＝0.49，P0.01)。WA%与FEV1/FVC、FEV1占预计值%(r值分别为－0.35、－0.35，P0.05)。WT%与FEV1/FVC、FEV1占预计值%(r值分别为－0.54、－0.51，P0.05)。mPAD%与气流阻塞程度呈正相关，mPAD%与FEV1/FVC(r＝0.42，P0.05)，mPAD%与FEV1%pred(r＝0.50，P0.01)。
讨论慢阻肺是一种慢性进行性的气道和肺实质炎症性疾病，慢性炎症导致小气道阻塞和肺泡毛细血管网破坏，从而引起有效的气体交换面积减少，氧运输减少，继发肺组织氧化损伤。而肺组织缺氧及肺血管重塑会促进肺血管阻力和肺动脉压力的升高[17,18]。低氧性PH是一种慢阻肺常见的并发症，其主要特征是肺动脉压力的持续升高和缺氧性肺血管重塑，而肺血管重塑的靶细胞主要是PASMC，其过度增殖和凋亡受阻及功能障碍导致细胞外基质的沉积是肺动脉重塑发生发展的核心。
本研究结果表明，慢阻肺组肺小动脉WT、WT%、WA%较对照组增高，且α-SMA蛋白及mRNA表达也较对照组增高；慢阻肺组PASMC增殖率及单位面积下增殖的PASMC数较对照组增高，提示慢阻肺患者在尚未出现明显肺动脉高压之前，即存在以肺动脉平滑肌细胞增生、增殖活性增高为主的功能改变。慢阻肺患者肺小动脉平滑肌功能障碍的原因是由于慢性炎症损伤还是慢性缺氧所致尚不得而知。Xu等[19]观察到慢性低氧暴露可致小鼠的肺小动脉中膜增厚、细胞外基质沉积，同时还导致右心肥厚指数及右心室收缩压力的显著升高。Santos等[20]发现慢阻肺早期阶段，即使没有明显的低氧，已存在PASMC增殖。本研究纳入的慢阻肺组患者平均氧分压较对照组明显减低，肺功能FEV1/FVC及FEV1占预计值%均较对照组明显降低，且小气道平滑肌重塑的指标WA%、WT%与气流受限的严重程度指标FEV1/FVC、FEV1占预计值%呈负相关的结果，提示慢阻肺患者肺小动脉重塑与气流阻塞程度相关，有关慢阻肺肺小动脉平滑肌重塑的原因考虑与缺氧及慢性炎症机制均相关。
目前慢阻肺合并PH的诊断方法是多样的。右心导管仍是金标准，但其具有一定的风险和并发症。经胸多普勒超声心动图作为一种无创的检查方法广为临床应用，但慢阻肺患者往往因肺气肿导致声波传导不良；此外，经胸多普勒超声对肺动脉压力的估测基于三尖瓣反流峰值，而慢阻肺患者获得高质量的三尖瓣反流信号的机会较低[21]。因此经胸多普勒超声心动图对慢阻肺患者临床应用存在一定的局限性。CMR是目前广为接受的用于评估近端肺循环和右心室功能的无创性金标准技术[22]，其能准确的量化肺血管阻力，研究表明在PH患者中应用CMR估测的mPAP与右心导管测量的mPAP相对比并无差异[7,23]。此外，CMR还可以提供包括主肺动脉血流动力学以及右心心肌质量及心脏结构等方面的信息。本研究发现慢阻肺组mPAP与对照组无显著差异，但是mPAD%较对照组明显降低。mPAD%是一个很好的评价肺动脉弹性的指标[24,25]，肺动脉在促进右心室搏出的血流流至毛细血管网的过程中起着非常重要的作用，保持这种右心室和肺动脉的关联性是维持右心血液动力学和整个肺血管压力的基础，而肺动脉弹性是调节这种关联性的至关重要因素，肺动脉弹性降低、僵硬度增加会导致右心工作负荷增加，这种动脉弹性的降低及随之增强的压力会传递至较小的肺血管，导致进一步的血管损伤[10]，本研究中慢阻肺组mPAD%与血管重塑指标WA%、WT%与呈负相关，与气流阻塞严重程度指标FEV1/FVC、FEV1占预计值%呈正相关，结合肺小动脉病理改变，提示慢阻肺早期就已存在以远端肺小动脉重塑和主肺动脉扩张度降低为特征的肺血管病变，而小动脉的重塑与主肺动脉扩张度降低与慢阻肺气流受限严重程度相关。
慢阻肺通常发生右心室结构与功能变化，究其根本原因是心肌为了适应逐渐增加的肺动脉的压力而发生的改变。Swift等[26]认为CMR在早期评估右心功能及结构改变方面具有高度的准确性，可以用于早期肺源性心脏病的检测。本研究中慢阻肺组右心室心脏结构及心肌质量的参数RVMI、RVMED、RVMES、ANF、RF%均较对照组升高；WA%、WT%与RVMES、RVMED、RF%呈正相关，，提示慢阻肺在尚未出现明显肺动脉高压改变时，就已经出现右心室形态及功能改变，我们推测慢阻肺患者早期右心结构及功能的改变与远端肺小动脉的重塑有关。而慢阻肺患者小血管重塑会影响主肺动脉血液流变学改变进而影响到右心心肌结构。
综上，慢阻肺在尚未出现肺动脉高压的情况下，即存在以小动脉重塑和肺动脉血液流变学改变为特征的血管病变及右心心肌的结构改变，且小动脉重塑影响主肺动脉血液流变学改变进而影响右心心肌结构改变。此外，肺小动脉重塑与慢阻肺气流受限相关，这可能是慢阻肺临床治疗的新方向。目前研究发现降低慢阻肺肺动脉压力的药物仅缓解症状，而对改善慢阻肺整体预后并无明显疗效。文献报道慢阻肺的血管重塑所引起的血管收缩与肺动脉阻力升高可加重气流受限导致慢阻肺疾病恶化[27]。有关慢阻肺肺血管重塑的发病机制方面大量研究表明低氧在慢阻肺肺血管重塑中发挥着举足轻重的作用。但在无或轻度低氧血症的慢阻肺患者的肺组织标本中也已经观察到肺动脉重塑[28]，且部分患者存在肺动脉高压[29]，提示慢阻肺患者肺血管重塑的机制较为复杂，因此针对慢阻肺患者肺血管重塑的研究可能为慢阻肺的治疗提供新靶点。
（参考文献）
预览时标签不可点收录于话题#个上一篇下一篇