撰文丨咸姐
责编丨翊竑
PCSK9（Kexin样前转化酶枯草杆菌蛋白酶家族的第9个成员）是一种参与调节肝脏低密度脂蛋白（LDL）受体生命周期的分泌性蛋白。PCSK9可以与LDL受体的胞外结构域结合，靶向该受体进行核内体降解，阻止LDL颗粒内化后再循环到肝细胞表面。研究发现，人类PCSK9的功能获得性突变与家族性显性高胆固醇血症有关，而其功能丧失性突变则可导致LDL胆固醇浓度降低并预防冠状动脉疾病的发生，这使得抑制PSCK9成为治疗#动脉粥样硬化#心血管疾病的一种极具吸引力的靶向疗法。
目前针对PSCK9的抑制主要有两类，一类是使用单克隆抗体（mAb），其可抑制循环中的PCSK9，从而降低LDL胆固醇水平，这一治疗策略被证明对心血管疾病患者有疗效；另一类是通过小干扰RNA（siRNA）抑制PCSK9的mRNA使其发生基因沉默，该方法最近已申请上市批准，并且其在降低血浆LDL胆固醇已展现出显著效果。但是，现阶段的治疗性PCSK9抑制剂都需要通过注射给药，这无疑给患者带来了诸多不便与痛苦，一种替代性的、更方便、无创的给药途径成为亟需解决的临床需求，以提高患者的依从性和治疗效果。
近日，来自瑞典阿斯利康制药公司的PeterGennemark团队在ScienceTranslationalMedicine上发表题为AnoralantisenseoligonucleotideforPCSK9inhibition的研究文章，开发了一种靶向PCSK9以调节LDL受体的反义寡核苷酸（ASO），其可以口服给药，并被肝脏吸收。皮下注射此ASO对PCSK9过表达的小鼠显示出很强的有效性，其在猴子肝脏中的半衰期为18天，并且可以有效减少人体循环中的PCSK9水平。同时，大鼠和犬类实验结果显示，与皮下注射相比，该ASO口服制剂的肝脏生物利用度为5%-7%，并且能降低健康猴子的LDL胆固醇。由此表明该ASO可以在避免注射的同时，具有抑制PCSK9的潜力。
本文研究人员开发出一种具有限制性乙基（cEt）化学修饰的强效16-核苷酸寡聚物，三触角型N-乙酰半乳糖胺（triantennaryN-acetylgalactosamine，GalNAc）反义寡核苷酸——AZD（也称为ION-），旨在靶向PCSK9mRNA，从而抑制细胞内蛋白翻译和PCSK9蛋白合成。当AZD给药被肝细胞摄取后，GalNAc将被切割，没有GalNAc部分的AZD即为母药，称为非偶联AZD（也称为ION-）。
首先，研究人员对过表达了人PSCK9的转基因小鼠进行每周皮下注射AZD，为期4周，以评估AZD的药效。结果显示AZD的肝脏暴露呈剂量依赖性增加，伴随着人血浆PCSK9和LDL胆固醇的剂量依赖性降低，并且与非偶联的母药ASO直接给药相比，AZD的药效增加了近10倍。随后，研究人员对野生型小鼠进行皮下给药后探究靶向PCSK9转录本的GalNAcASO能在多大程度上降低相关的血脂异常生物标记物。结果显示，靶向小鼠PCSK9转录本的GalNAcASO（ION-）可以有效降低小鼠血浆PSCK9蛋白浓度，诱导肝脏LDLR表达，从而降低血浆总胆固醇和LDL胆固醇浓度。
进一步地，研究人员在食蟹猕猴体内研究AZD的药代动力学（PK），每月皮下注射4次，并第一次给药后1周额外给药一次。结果发现AZD表现出非线性PK，最大肝脏浓度随剂量的增加不成比例地增加。而非偶联AZD的肝脏半衰期为数周，并且AZD的肝脏暴露浓度符合预期。此外，研究证实，在人体LDL胆固醇基线浓度为±3.9mg/dl时，单次皮下注射AZD（12、30和90mg）可显著降低血浆PCSK9蛋白浓度，且呈剂量依赖性，而在剂量随访期后的16周内，PCSK9和LDL胆固醇均缓慢恢复至基线水平或接近基线水平。
为了研究AZD口服给药的潜力，研究人员采用经空肠（IJ，此模型可模拟口服片剂）和皮下单剂量给药对空肠插管大鼠的肝脏生物利用度进行了量化。在所需的肝脏浓度为4μg/g、且转基因小鼠的数据预计会导致PCSK9减少80%时，与皮下注射AZD相比，IJ的肝脏生物利用度为5.3%。与此同时，研究人员给比格犬每天口服AZD片剂，持续7天或28天，测量血浆和肝脏暴露。随着时间的推移，未偶联的AZD在肝脏中积累，肝脏的生物利用度为5%，是血浆生物利用度的5倍，提示AZD在肝脏被积极吸收。此外，研究人员将含有增强剂的大鼠特异性替代ASO溶液对大鼠进行IJ给药，以及给予食蟹猕猴口服片剂后，观察到血浆中PCSK9和LDL胆固醇都显著降低，由此进一步证明了口服给药的靶向作用。最后，基于人体口服给药后肝脏生物利用度为5%的假设，与每月皮下注射一次（25mg/月）AZD相比，研究人员预测每日15mg的口服剂量将使循环PCSK9在稳定状态下减少80%，从而支持了用于口服治疗血脂异常的化合物的开发。
综上所述，本研究提出了一种具有口服给药潜力的有效的PCSK9抑制剂——GalNAc偶联ASO（AZD），其口服给药潜力主要源于两个重要特性：第一，由于cEt化学修饰和GalNAc的偶联使得AZD具有肝细胞靶向性，使得其给药剂量减少，有效性增强；第二，AZD的肝脏半衰期可达数周，从而使得其在每天重复给药一次后随时间在肝脏中累积。本研究不仅揭示了AZD皮下给药后的药代动力学和药效学特征，证明其在动物和人体内的高药效，而且还在大鼠、犬、猕猴的一系列实验中探讨了AZD口服给药的可行性，由此支持AZD作为口服剂型的发展，并显示了ASO口服给药的潜力。
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